Mit 15 Jahren gewann sie einen Talentwettbewerb. Durch den damit zusammenhängenden Vertrag bekam sie Auftritte in Fernsehshows und Musikvideos. Ihr Filmdebüt hatte Penélope Cruz mit El laberinto griégo (1991). Mit Regisseur Pedro Almodóvar arbeitete sie das erste Mal für Live Flesh. Mit Haut und Haar (1997) zusammen. Im selben Jahr spielte sie die Hauptrolle in dem Mysteryfilm Virtual Nightmare – Open Your Eyes, der mit ihr in derselben Rolle als Vanilla Sky (2001) für das amerikanische Kino mit Tom Cruise neu verfilmt wurde. Ihren ersten weltweiten Filmerfolg hatte sie mit Almodóvars Oscar-gekröntem Streifen Alles über meine Mutter (1999). Dann war Cruz unter anderem zu sehen in Woman on Top (2000), Blow (2001) mit Johnny Depp, Corellis Mandoline (2001) neben Nicolas Cage, Gothika (2003) mit Halle Berry, Sahara (2005), Almodóvars Volver – Zurückkehren (2006) und Bandidas an der Seite von Salma Hayek. Für ihre Darstellung in Volver – Zurückkehren erhielt Cruz gemeinsam mit ihren Filmpartnerinnen den Darstellerpreis auf den 59. Internationalen Filmfestspielen von

Cannes, dann einige Monate später den Europäischen Filmpreis 2006 als Beste Darstellerin. 2007 wurde sie als Beste Hauptdarstellerin erstmals für den Oscar nominiert. Penélope Cruz war von 2001 bis 2004 mit Tom Cruise liiert. Danach war sie zwei ganze Jahre lang mit dem Schaupieler Matthew McConaughey zusammen.